46  IF分析

客观的免疫荧光图像自动分析

Published

July 22, 2025

1. 免疫荧光图像人工主观评价的问题

对于免疫荧光图像分析的方法，通过文献检索，可能会发现很多文章都是通过人工主观评价来验证的。

比如下面这两篇文章(1), (2)，作者通过眼睛观察图像，来判断胞内菌是否和宿主细胞蛋白共定位。

笔者曾经也用这种方法统计共定位，但是在操作过程中：

  • 无法客观的选择胞内菌（主观的不由自主的选择期望的共定位或不共定位的胞内菌）。
    • 有点像所谓的：通过“理论”推测来选择数据😂，虽然主观上无造假的想法。
  • 累眼睛，进而累心。
    • 特别是组别多和耗时长的时候。
  • 有时候主观认为某种模式属于共定位，有时候又认为其不属于共定位。
    • 也就是：前后标准不一致。

最终的结果是：担心不能真实反映组间差异。

还有，从2025年6月1日起，多个Nature系列期刊（即《Nature Communications》、《Nature Cell Biology》、《Nature Methods》、和《Nature Structural & Molecular Biology》）(3)：

鼓励作者将其显微镜数据集存储在公共数据仓库中，正如基因组学和蛋白质组学等其它领域要求的那样 (3)。

可以想象，在以后的某个时间点，图片相关数据也可能被杂志强制要求共享到公共数据库，以供感兴趣的人员重复和使用。

2. 客观的分析

  • 客观的免疫荧光图像自动分析服务。

客观的图片分析，能够避免人为主观分析的各种缺点，比如(1)相对随意的图片区域选择；(2)不同分析人员之间的标准差异；(3)同一分析人员不同时间的标准差异等，因此可以保证结果的可重复性。

2.1. 客观的免疫荧光图像自动分析流程

2.1.1 理论基础

免疫荧光（IF）是一种重要的免疫化学技术，能够在不同类型的组织和各种细胞制备中检测和定位多种抗原(4)，比如用于分析胞内菌和宿主细胞互作(2)、用于肿瘤的免疫治疗(5)等。

本流程通过无差别的选择视野（图片）中的所有胞内菌，并进行特定光通路对应区域的信号强度分析、及共定位分析，以实现客观的免疫荧光图像自动分析。

2.1.2 流程和实例

说明：示例所用共聚焦图片通过莱卡共聚焦显微镜获得，采用40×物镜，图片保存格式为tif。

给我买杯茶🍵

References

1.
X. Chen, X. Cao, Y. Lei, A. Reheman, W. Zhou, B. Yang, W. Zhang, W. Xu, S. Dong, R. Tyagi, Z. F. Fu, G. Cao, Distinct persistence fate of mycobacterium tuberculosis in various types of cells. mSystems 6 (2021).
2.
L. H. Franco, V. R. Nair, C. R. Scharn, R. J. Xavier, J. R. Torrealba, M. U. Shiloh, B. Levine, The ubiquitin ligase Smurf1 functions in selective autophagy of mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host & Microbe 21, 59–72 (2017).
3.
Editorial, Light microscopy reporting for reproducibility. Nature Cell Biology 27, 877–877 (2025).
4.
K. Im, S. Mareninov, M. F. P. Diaz, W. H. Yong, “An introduction to performing immunofluorescence staining” in Biobanking (Springer New York, 2018; http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4939-8935-5_26), pp. 299–311.
5.
J.-R. Lin, Y.-A. Chen, D. Campton, J. Cooper, S. Coy, C. Yapp, J. B. Tefft, E. McCarty, K. L. Ligon, S. J. Rodig, S. Reese, T. George, S. Santagata, P. K. Sorger, High-plex immunofluorescence imaging and traditional histology of the same tissue section for discovering image-based biomarkers. Nature Cancer 4, 1036–1052 (2023).